PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與靈敏性高，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。

一、污染原因

(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于 密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提 取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠 或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。

(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣 槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。

(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的 檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化 過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn) 便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。

二、污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染。

對(duì)照試驗(yàn)

1、陽性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性 對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽 性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)。但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽 性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。

2、陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用 鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑 對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3、重復(fù)性試驗(yàn)

4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

三、防止污染的方法

(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定 等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。 最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)；②PCR反應(yīng)液制備區(qū)；③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)；④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。 其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸 樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先 配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一 冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的低量的標(biāo)準(zhǔn)病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照 及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前 應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。