由于miRNA(microRNA)分子序列較小，僅20nt左右，沒有真核生物的Poly(A)尾巴結構，采用傳統(tǒng)Oligo dT引物和隨機引物很難獲得從miRNA到cDNA的反轉錄產物。目前普遍采用的解決方案有兩種：特異性反轉錄引物（圖1A所示）、兩步加A法反轉錄方案（圖1B所示）。

本公司開發(fā)出一套全新的一步法miRNA反轉錄試劑盒，基于Peter改良的miR-Q技術，可以對成熟的miRNA同時完成Poly(A)反應和反轉錄反應，直接獲得含有特異性tag和15(T)的cDNA產物（如圖2所示）。該方法使得miRNA反轉錄與mRNA的反轉錄一樣輕松,直接將提取的microRNA與反應緩沖液混合物混合并置于PCR儀上1小時即可獲得高濃度的、包含所有miRNA分子的cDNA產物,獲得的cDNA產物適合于采用SYBR Green染料法進行RealTime PCR進行定量檢測。

一步法miRNA反轉錄試劑盒恒溫擴增使用策略及實例展示

應用實例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標準定量PCR儀或恒溫熒光儀上進行反應。以體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應25min的檢測結果，可以看到檢測反應<20min(達平臺期)。

應用實例2： 用 LP1002引物組進行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應結束后，倒置反應管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質耐受性很好。以體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應20min后檢測結果。

應用實例3：A3825-01 紅黃變色反應（肉眼觀察）

以 體外轉錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結束反應起

始前，下圖為 65 度反應 30min 后。

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